SERS技术在活体应用中的最新研究进展

SERS（Surface-enhanced Raman scattering, 表面增强拉曼散射）是使用特殊的衬底来增强待测样品的Raman光谱信号的一种方法，其增强效应主要源自电磁场增强机制^[1-6]。相比传统临床成像技术（如CT、MRI、PET等），SERS具有非侵入性、高灵敏度、高特异性等优势，且避免了电离辐射风险^[7]。Kang等人^[8]2006年首次报道活体葡萄糖传感应用，2008年Nie课题组^[9]和Gambhir课题组^[10]分别实现靶向癌细胞的活体检测和多种生物标志物的同步检测与区分。这些开创性研究为后续活体应用奠定了方法学基础^[6,11-22]。

组织在可见光区域(<650nm)存在强吸收、自发荧光和散射等问题^[26-28]。NIR-I(650-900nm)和NIR-II(1000-1700nm)窗口因组织吸收系数低而更适活体应用^[29]。初始研究多采用785nm激光(Si探测器)，随着InGaAs探测器发展逐步转向NIR-II窗口^[28]。各向异性纳米结构（纳米棒^[12,23]、纳米星^[18,24,25]、纳米壳^[15,16]可调控LSPR至NIR窗口，金纳米材料因其生物相容性和光学特性，比银纳米材料更受青睐^[6,15,16,18]。

1. 体内SERS策略

1.1 直接检测策略（无标记SERS）

1.1.1 原理与优势

• 化学特异性：直接检测利用分子自身振动信号（如蛋白质^[34]、核酸^[36]、病原体^[37-38]），无需额外标记，可直接获取生物分子的化学结构信息。

• 非侵入性与简化流程：适用于临床快速分析，避免了标记分子可能引起的毒性或干扰。

1.1.2 局限性

• 信号弱：

• 生物分子的拉曼散射截面小，低浓度目标物在复杂基质中易被背景噪声掩盖。

• 大分子（如蛋白质、DNA）的主峰重叠严重，需复杂数据处理。

• 重现性差：生物环境中分子运动自由度大，导致信号波动。

1.1.3 改进方向

近年来，研究人员通过优化SERS基底（如粗糙金属表面或纳米结构）和开发高效算法提升灵敏度^[40]。例如，直接SERS已用于活体葡萄糖检测和植物内源信号分子监测^[128]。

1.2 间接检测策略（靶向SERS纳米探针）

间接检测通过功能化纳米探针增强信号，克服了直接法的不足。探针通常包含四部分（图1）^[39-40]：

1.2.1   SERS基底：贵金属纳米颗粒（如Au、Ag）通过局域表面等离子体共振（LSPR）增强电磁场。

o   设计要点：

§   NIR窗口优化：近红外（650-1700 nm）激发减少组织吸收和自发荧光。

§   结构多样性：如纳米棒（Au NRs）、纳米壳、纳米星等，通过几何调控LSPR峰位。

§   热点工程：纳米间隙（内部/外部）可提升增强因子达1011。

1.2.2 拉曼标记化合物（RLCs）：

o   选择标准：

§   大拉曼截面（如π电子体系）、近红外共振（如CyNAMLA-381比DTTC灵敏度高12倍）。

§   生物正交基团（如炔烃、叠氮化物）可避免背景干扰。

o   复用能力：多色编码（如14种RLCs）实现多重检测。

1.2.3 保护层与生物配体：

o   稳定性：聚乙二醇（PEG）或二氧化硅包覆延长循环时间。

o   靶向性：抗体、适配体等通过硫醇/点击化学偶联。

图1 a 典型SERS纳米探针的结构示意图，由作为SERS基底的等离子体纳米颗粒、拉曼标记化合物、保护层和生物配体组成。b 纳米球。c 纳米棒。d 空心/壳层纳米颗粒。e 纳米星。f 含内部间隙的纳米颗粒。g含外部间隙的纳米颗粒。

2. 体内SERS技术的仪器设计与发展趋势

2.1 活体SERS仪器的基本设计考量

SERS技术在活体生物医学应用中的成功实施高度依赖于仪器系统的精心设计和优化。活体SERS检测仪器设计需考虑多种生物光学特性与技术参数的平衡。

2.1.1 激发波长的选择

• 近红外I区窗口(650-900     nm)：785 nm激光因其在组织穿透深度(通常达几个毫米)和信噪比之间的平衡成为首选。相较于可见光(<650 nm)，785 nm可显著降低组织自体荧光和背景信号，同时保持相对较高的探测灵敏度。

• 近红外II区窗口(1000-1700 nm)：使用1064 nm激发可提供更深层组织穿透(达厘米级)，但需要InGaAs检测器替代硅基CCD，且系统成本显著提高。组织在1064 nm的吸收系数比785 nm低约两个数量级，特别适合深层组织成像。

选择适当的激发波长对于最小化生物样品中的激光吸收、散射和自体荧光至关重要。785 nm激光因其灵敏度、信号强度、整体性能、成本效益和有效穿透组织的能力而被广泛青睐。

2.1.2 安全性与功率控制

活体应用必须严格遵守美国国家标准学会(ANSI)的“最大允许曝光量(MPE)”标准。对于皮肤：

• 可见光波长：0.2 W/cm²。

• 700-1050 nm：随波长增加至1 W/cm² 。Bohndiek等开发的小动物拉曼成像(SARI)系统使用785 nm激光在焦平面处290 mW功率，通过105 μm多模光纤传输，实现了安全有效的活体成像。

2.1.3 光学元件选择策略

• 物镜选择：活体成像推荐使用低倍物镜(10×, 20×)，NA值0.25-0.50，工作距离数毫米，可在空间分辨率和穿透深度间取得平衡。

• 检测器优化：785 nm激发通常选用硅基CCD(敏感范围750-1050 nm)，而1064 nm激发需采用InGaAs检测器。电子倍增CCD(EMCCD)对于微弱信号检测特别有利，可通过信号放大提高信噪比。

2.2 显微系统配置的创新进展

显微系统在活体SERS检测中面临成像速度与灵敏度的权衡问题，近年发展出多种创新技术，如扫描式成像技术、REMI技术、宽场成像技术等。

2.2.1 扫描式成像技术

点扫描技术

• 原理：激光束逐点扫描样品，每(x,y)位置记录全光谱。

• 优势：高空间分辨率，完整光谱信息。

• 限制：成像速度慢(典型区域需数小时)。 Nie课题组^[9]早期工作使用60 nm金纳米粒子，通过点扫描实现了皮下肿瘤成像，但需使用散焦光束降低光学损伤风险。

线扫描技术

• SARI系统：Bohndiek等^[14]开发。

• 采用线照明+二维EMCCD。

• 成像面积31×25 mm²(>6 cm²)，30分钟内完成。

• 空间分辨率250×64 μm。

• 显著提高成像速度(5×5 mm²区域仅需1.5分钟)。

这种SARI系统相较于传统显微镜系统提高了成像速度，同时保持了选择性、多路复用能力以及光谱和空间分辨率。

2.2.2 REMI技术

Wang等^[97-98]报道的拉曼编码分子成像(REMI)技术特点：

• 785 nm激光(10-15     mW)，通过36根多模光纤形成亚毫米光斑。

• 50×50 mm²扫描范围，分辨率0.2-1 mm可调。

• 15分钟内完成双标记物同步定量。

• 后续扩展到至少四种生物标记物的检测。

2.2.3 宽场成像技术

Mallia等^[99]开发的SERS宽场成像系统特点：

• 采用785 nm激发和电动干涉滤光片。

• 每个SERS信号仅需三幅图像(峰值及两侧)。

• 成功实现对皮摩尔浓度硅包裹的60 nm金纳米颗粒的成像。

• 可进行高分辨率四重成像

• McVeigh等进一步优化的宽场多重SERS成像系统：

• 使用窄带通滤光片消除组织自体荧光干扰。

• 实现大面积(>1 cm²)快速成像(<5秒/波段)。

2.3 光纤系统配置与临床应用

光纤系统解决了活体深部组织检测和术中导航的关键需求。

2.3.1 内窥镜系统

旋转光谱内窥镜

Zavaleta等^[106-107]开发的内窥镜特点：

• 柔性光纤束实现非接触成像。

• 照明光斑直径~1 mm。

• 无刷直流电机驱动镜面360°旋转扫描。

• 可显示为平面2D图像或柱面投影

• Wang等^[109]应用于食管癌检测：

• 顶部施用SERS纳米探针。

• 实现食管壁的多重分子成像。

双模态荧光-Raman内窥镜(FRES)

Jeong等^[19,104]开发的FRES系统：

• 同步获取荧光(快速成像)和SERS(多重检测)。

• 靶向EGFR和VEGF的荧光-SERS纳米点(F-SERS dots)。

• 临床前研究显示可精确追踪肿瘤区域。

这种方法将拉曼光谱的特异性与荧光成像的通用性和速度相结合。它有助于实时荧光成像检测肿瘤，帮助手术切除，并使用拉曼光谱验证术后切缘。

2.3.2 空间偏移拉曼光谱(SORS)

SORS技术通过收集与激发点偏移的散射光，减少表层影响，实现深层探测：

• 穿透深度：常规拉曼≈1-2 mm；SORS可达45-50 mm。

• 活体应用：Sharma等通过猫头骨检测到100 μM神经递质。

• 表面增强SORS(SESORS)：结合SERS纳米探针，穿透力进一步提升。

• Vo-Dinh团队^[125]报道的逆向SORS：

• 使用金纳米星，通过5 mm厚的猴头骨获取信号。

• 验证了颅骨穿透检测的可行性。

• Nicolson等^[116]的手持式SESORS：

• 可检测乳腺肿瘤模型中15 mm组织深处的信号。

• 临床转化潜力显著。

2.4 术中导航技术创新

术中SERS成像系统在肿瘤边界界定方面展现了独特价值。

2.4.1 脑肿瘤精准切除

Kircher等^[13]开发的三模态纳米颗粒(MRI-光声-拉曼, MPR NPs)：

• 60 nm金核+30     nm二氧化硅壳。

• 术前MRI定位→术中用光声引导大体切除→拉曼识别残余微肿瘤。

• 临床前模型显示可识别浸润性肿瘤边缘。

• Han等^[137]采用表面增强共振拉曼散射(SERRS)标记。

• 在大鼠模型中实现预后改善。

• 手术导航与治疗效果监测结合。

2.4.2 手持式探测设备

Nie课题组^[101]的SpectroPen特点：

• 便携式NIR激发设备。

• 同时检测荧光和SERS信号。

• 肿瘤边界检测灵敏度高。

• Karabeber等^[102]的手持拉曼扫描仪：

• 可在术中发现胶质母细胞瘤微病灶。

• 接近实时检测(与静态显微拉曼设备相比)。

2.4.3 比例计量策略

Oseledchyk等^[77]开发的靶向/非靶向纳米星比例成像。

• αFR-NP(叶酸受体靶向，IR780标记)。

• nt-NP(PEG修饰，IR140标记)。

• 腹腔注射后，精确识别卵巢癌腹膜播散灶。

• Bao等^[141]的前哨淋巴结检测。

• 叶酸功能化靶向GERTs。

• 实现转移淋巴结的术中识别。

2.5 挑战与未来方向

尽管取得显著进展，活体SERS仪器仍面临多重挑战：

2.5.1 深度与速度的平衡

• 深层成像：NIR-II窗口(1064 nm)提供更好穿透但系统复杂。

• 快速成像：宽场技术牺牲光谱分辨率，扫描式技术速度受限。

2.5.2 临床转化障碍

• 成本：高灵敏度InGaAs检测器和可调滤光片价格昂贵。

• 标准化：缺乏统一的操作和分析协议。

• 审批：SERS纳米探针的安全性评估体系尚不完善。

2.5.3 智能整合方向

Yang等提出的增强现实解决方案^[118]：

• 手持探针+光学定位相机。

• 实时拉曼图像重建和分子VR可视化。

• 空间分辨率0.5 mm，满足手术需求。

• 深度误差<1 mm，临床兼容性好。

2.5.4 多模式融合趋势

• 光声-Raman：结合结构与分子信息。

• 荧光-Raman：速度与特异性兼备。

• MRI-Raman：术前计划与术中导航衔接。

图2 用于活体应用的拉曼仪器系统。

(a)拉曼成像方法示意图及(b-e)多种活体拉曼成像光学系统。

(b)用于广域测绘与表征的小动物拉曼成像仪器(SARI)系统光学设计及线扩散函数。SARI采用激光线沿x轴和y轴进行栅格扫描的线扫描模式。

(c)基于白光内窥镜的拉曼成像系统示意图。无刷直流电机驱动旋转镜对准直光束进行360度扫描，实现结肠壁管腔成像。

(d)532 nm激光荧光-拉曼内窥显微系统(FRES)光学设计。Mx和My分别为x轴和y轴振镜，BS为分束器，DF为二向色滤光片，LP为长通拉曼边缘滤光片。信号经DF分成两个检测区域：荧光检测区(瑞利线≥2000cm−1以上)和拉曼检测区(1250-2000cm−1)。 (e)785 nm激光表面增强空间偏移拉曼光谱(SESORS)仪器示意图。插图显示光纤采集与检测端。将含反式-1,2-双(4-吡啶基)乙烯(BPE)的纳米探针注入组织后进行SESORS光谱采集。

3. SERS技术在活体中的应用

3.1 活体传感与诊断

3.1.1 技术原理：
SERS通过纳米探针（如Au/Ag纳米结构）在近红外窗口（NIR-I:650–900 nm；NIR-II: 1000–1700 nm）实现高灵敏度检测，克服生物组织对可见光的强吸收和自发荧光干扰^[26-28]。

• 直接检测：依赖分子固有振动指纹（如葡萄糖、神经递质），但受限于信号弱和背景噪声^[8,111]。

• 间接检测：使用SERS纳米探针（含拉曼标签化合物RLCs）增强信号，如DTTC染料在785 nm激发下实现皮下葡萄糖监测^[120-121]。

• 典型案例：

• 葡萄糖监测：Yuen等^[121]通过皮下植入银膜纳米球基底，结合空间偏移拉曼光谱（SERSORS）实现大鼠间质液葡萄糖实时检测，灵敏度达生理浓度范围（0.1–30 mM）。

• 神经递质检测：Sharma团队^[124]通过猫头骨phantom模型，利用SERSORS检测血清素、褪黑素等神经递质，极限浓度低至100 μM。

• 植物应激分子成像：Son等^[128]开发Ag纳米壳传感器，直接注入活体植物（如小麦），监测ATP、水杨酸等分子，实现真菌感染的早期诊断。

• 挑战：
  穿透深度受激光波长限制（如785 nm穿透<4     mm），且需解决生物相容性和长期稳定性问题^[117]。

图3 基于表面增强拉曼散射（SERS）的活体检测与诊断技术
a 采用纳米球表面银（或金）膜基底植入活体大鼠实现的SESORS技术在体葡萄糖监测。

b通过猫颅骨对脑组织模拟物中神经递质（褪黑素、血清素和肾上腺素）进行的SERS检测。

c基于AgNS@PDDA表面拉曼增强效应的活体作物真菌病害早期诊断示意图。拉曼光谱显示胞外三磷酸腺苷（ATP）、水杨酸（SA）及真菌的SERS信号。

3.2 生物分子筛选与多重成像

3.2.1 技术优势：
SERS纳米探针的窄谱带特性（半宽<2 nm）支持高通道多重检测（如14种RLCs同时区分）^[90]，远超荧光技术的限制^[39]。

l   组合化学库：如CyNAMLA染料库通过固相合成衍生80种化合物，灵敏度较商用DTTC提升12倍^[59,60]。

l   比例量化：Kang等^[6]通过抗TSPAN8抗体标记的NIR-SERRS点，在结肠癌小鼠模型中实现单次实验多抗体亲和力验证。

3.2.2 应用场景：

·       肿瘤微环境分析：Gambhir团队^[11]通过五种颜色SERS探针同时成像裸鼠皮下肿瘤，定量分析多生物标志物。

·       ‍药物筛选：RLC编码的纳米探针可高通量筛选药物候选分子，减少实验次数（如单次实验替代N次顺序检测^）[129-130]。

3.2.3 局限：
多探针共存时需解决光谱重叠问题，且需优化信号均一性^[64]。

图4 体内多重检测与定量分析
a 多重分析与顺序分析的对比。多重检测可显著减少实验次数。
b 具有多重检测能力与高灵敏度的拉曼标记化合物的组合合成与筛选。
c 注射不同浓度SERS探针的荷瘤小鼠体内五重比率型SERS成像。
d 785nm光激发下14种不同拉曼标记化合物的独特SERS光谱，每种化合物均显示特征峰。

e基于比率定量SERS分析的体内多重抗体验证策略。

3.3 术中导航与治疗

3.3.1 技术整合：
结合SERS与其他成像模式（如MRI、光声成像）实现术前定位与术中实时引导。

·       药物筛选：RLC编码的纳米探针可高通量筛选药物候选分子，减少实验次数（如单次实验替代N次顺序检

·       脑肿瘤切除：Kircher等^[13]开发三模态纳米颗粒（MPR NPs），术前MRI定位肿瘤，术中光声-拉曼双模引导切除，残留肿瘤检测限达单个细胞级别。

·       卵巢癌腹膜转移：Oseledchyk^[77]采用靶向/非靶向SERS探针比例成像（αFR-NP/nt-NP），精确识别肿瘤病灶（特异性>90%）。

3.3.2 治疗协同：

·       光热-化疗联用：Zhang等^[144]设计负载顺铂的GERTs纳米探针，通过808 nm激光实现SERS成像引导的局部热疗与药物释放，小鼠模型肿瘤完全消退率显著提升。

·       NIR-II窗口优势：He等证明1064 nm激发穿透深度达10mm，光热转换效率67.1%，优于NIR-I窗口^[146]。

图5 术中SERS引导的肿瘤切缘判定。

(a)SERS引导下脑肿瘤序贯切除及切缘判定全过程演示，直至肿瘤完全切除。

(b)比率型SERS成像用于播散性卵巢癌病灶定位，靶向与非靶向SERS纳米探针的比率成像可特异性显示肿瘤区域并消除非特异性分布信号。

(c)结肠癌模型上荧光-拉曼同步检测策略，助力肿瘤分子特征解析。

3.3.3 临床转化障碍：
需解决探针的体内清除效率（如Kupffer细胞摄取问题）和长期毒性^[155]。

3.4 未来方向与挑战

·       NIR-II窗口优化：开发Au/Ag合金纳米壳等材料，将 plasmonic 共振调至1400 nm，提升穿透深度与信噪比^[147-148]。

·       AI辅助分析：机器学习可加速SERS数据解译，如Yang等^[118]通过增强现实（AR）实时重建拉曼图像，手术边界分辨率达0.5 mm。

·       多模态平台：整合OCT、光声成像等，提供结构-功能-分子多维信息^[117]。

SERS技术在活体应用中展现出高灵敏度、多重检测和精准治疗潜力，但临床转化需进一步解决穿透深度、生物安全性及标准化协议等关键问题。

4. SERS纳米探针临床转化面临的挑战

4.1 光学窗口的穿透深度限制

• NIR-I与NIR-II窗口的权衡：

• NIR-I窗口（650-900 nm）虽成本低且设备成熟，但穿透深度有限（通常<5      mm），仍受组织吸收和自发荧光干扰^[28]。

• NIR-II窗口（1000-1700 nm）可显著降低散射和吸收，实现更深组织穿透（如50      mm以上）^[147]，但需依赖昂贵的InGaAs探测器和1064 nm激光源^[28]。

• 研究进展：作者提到Au/Ag合金纳米壳通过调控孔隙结构可将等离子体共振扩展到NIR-II区，实现皮下微肿瘤的高灵敏度检测^[147]。

• 信号衰减问题：

• 纳米探针聚集可能导致信号恢复率下降，需通过表面修饰（如聚合物包覆或电荷调控）改善稳定性^[149]。

4.2 纳米探针的设计与安全性

• 尺寸与清除效率的矛盾：

• 小尺寸纳米颗粒（<20 nm）易被肝脏Kupffer细胞快速清除，而大颗粒（>30 nm）虽增强SERS信号但可能滞留于单核吞噬系统（如脾脏），引发长期毒性^[155]。

• 表面修饰策略：PEG化可延长血液循环时间^[82]，而仿生细胞膜涂层（如红细胞膜）能进一步降低免疫识别^[156]。

• 靶向性与非特异性结合：

• 纳米探针需通过抗体、适配体或叶酸受体等配体实现肿瘤靶向^[6,77]，但非特异性结合（如网状内皮系统摄取）仍可能干扰成像特异性。为解决此问题，研究采用比率型SERS成像，通过比较靶向与非靶向探针信号消除背景干扰^[77,141]。

4.3 仪器与数据处理的瓶颈

• 实时成像速度与分辨率：

• 传统点扫描SERS显微镜耗时较长（如大范围扫描需数小时），而宽场成像（如SARI系统）虽提速但牺牲光谱分辨率^[14,99]。

• 解决方案：线扫描（如REMI技术）结合AI辅助分析可实现大组织区域（50×50 mm²）的快速多标记得检测（15分钟内）^[97]。

• 计算与可视化技术：

• Yang等（2022）^[118]开发了基于增强现实（AR）的手持式拉曼成像系统，通过实时3D重建将分子数据叠加至组织表面，空间分辨率达0.5 mm，但需进一步降低硬件成本以适应临床需求。

4.4 生物相容性与标准化

• 毒性风险：

• 银纳米颗粒（Ag NPs）虽SERS活性高，但生物毒性高于金纳米颗粒（Au NPs），需控制剂量（如<50 mg/kg）并通过二氧化硅或聚乙二醇包覆降低毒性^[48,156]。

• 体内代谢研究不足：目前多数实验限于小动物模型，缺乏人类药代动力学数据，需推进长期安全性评估^[150]。

• 标准化协议缺失：

• SERS信号增强受基底形貌（如纳米星尖端、纳米间隙）影响显著^[18,53]，但尚无统一的生产和质量控制标准，阻碍规模化应用。

4.5 多模态整合的未来方向

• SERS与其他技术的协同：

• 光声成像（PAI）与MRI：如Kircher等（2012）^[13]开发的MPR纳米颗粒，结合术前MRI定位、术中PAI-SERS双模引导，实现脑肿瘤边缘精准切除。

• 荧光-SERS双模态探针：荧光快速定位病灶，SERS提供分子特异性，适用于内镜辅助的结直肠癌手术^[104]。

• AI与机器学习：

• 深度学习可解析复杂SERS光谱，区分健康与病变组织，但目前算法依赖高质量训练数据，需扩大临床样本库验证。

5. 结论

本综述全面探讨了体内表面增强拉曼散射（SERS）技术的最新进展与应用，凸显了其在多个生物医学领域的重大潜力。在活体应用中，自发拉曼散射虽具有优异的化学特异性，但受限于信号微弱、成像速度慢及穿透深度浅等问题。不过，通过优化激发光源和改进检测技术，自发拉曼散射在活体与离体生物医学成像（尤其是表层组织分析）中的实用性已获得提升。相较而言，SERS技术在克服自发拉曼散射的固有局限性方面取得了更为显著的突破：通过开发新型SERS纳米探针，其检测灵敏度、结果可重复性、多重检测能力、多功能性和生物相容性均得到显著增强；近红外激发技术与光学可调SERS基底的进步有效提升了组织穿透深度并降低了背景干扰；显微扫描与广域成像系统、柔性精密光纤装置等仪器创新，使活体SERS成像成为生物医学研究的强有力工具。

基于SERS的检测技术在癌症诊断、术中导航及生物过程实时监测方面展现出重要潜力。多功能SERS纳米探针实现了精准肿瘤成像与靶向治疗，显著提升了光热疗法与化学疗法的疗效。尽管取得重大进展，该技术仍面临穿透深度提升、高质量图像采集时间缩短、背景自发荧光抑制及生物相容性保障等关键挑战，这些因素对临床转化至关重要。随着对纳米探针设计的持续优化、成像方法的系统改进以及经济型实时成像设备的研发，SERS技术在近红外二区窗口的活体成像应用前景广阔。预计机器学习与人工智能将进一步提升数据解析效率，实现更快速精准的诊断。持续的技术创新必将推动SERS成像成为个性化医疗和肿瘤靶向治疗不可或缺的重要工具。

更多详情请查看原文：

ChangH, Hur W, Kang H, et al. In vivo surface-enhanced raman scattering techniques:nanoprobes, instrumentation, and applications[J]. Light: Sci. Appl., 2025,14(1): 79. （Q1 IF 20.6）

DOI：10.1038/s41377-024-01718-5

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