方法一：透析 (Dialysis)

1. 原理：透析基于扩散原理。将蛋白质样品装入一个只允许小分子（如盐离子、化合物）通过而大分子（如蛋白质）不能通过的半透膜袋中。然后将此透析袋浸入一个目标成分的缓冲液中（称为透析液）。膜内外的溶液相互扩散，直到内外溶液达到平衡，通过多次更换外液，可以有效地将袋内的小分子杂质去除。

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2. 透析袋的关键参数： 膜的截留分子量（Molecular Weight Cut-Off, MWCO）

• 核心定义：截留分子量（MWCO） 是指透析袋能有效阻挡（即截留）90%以上的球形分子的最小分子量。

  MWCO越小：孔径越小，对目标分子的截留效果越好（回收率高），但透析速度越慢（达到平衡所需时间更长）。

  MWCO越大：孔径越大，透析速度越快（节省时间），但目标分子泄漏的风险增加（回收率可能降低）。

• 关键理解要点：不是一个绝对的“开关”：MWCO不是一个精确的界限，不是说比MWCO小的分子就100%能透过，大的就100%不能透过。它是一个统计概率值。例如，一个10 kDa的蛋白质在10 kDa MWCO的透析袋中，可能会有少量缓慢泄漏，但绝大部分（>90%）会被保留在袋内。

• 与分子形状有关：MWCO通常基于球形蛋白质（如球蛋白）进行标定。如果您的样品是线性分子（如DNA、RNA或线性多肽），它们的透过行为会不同。一个线性的10 kDa DNA片段可能比一个球形的10 kDa蛋白质更容易透过相同MWCO的透析袋

• 单位：通常以道尔顿（Dalton, Da）或千道尔顿（kDa）表示。常见规格有：1 kDa, 3.5 kDa, 8 kDa, 10 kDa, 8-14 kDa, 25 kDa, 50 kDa, 100 kDa等。

3. 如何选择透析袋MWCO：通常选择待纯化蛋白质分子量的1/3到1/2。

选择MWCO的核心原则是：确保您的目标大分子被有效截留，同时让需要去除的小分子杂质快速扩散出去。通常，在保证足够回收率（>95%）的前提下，可以选择稍大一点的MWCO以节省时间。但对于珍贵样品，应优先保证回收率，选择更小MWCO的透析袋。

• 确定目标分子与待除去分子的分子量。

• 使用“1/3 - 1/2”经验法则：
  这是一个被广泛采用且非常有效的经验法则。
  选择的MWCO应该小于目标分子量的 1/2 到 1/3。

举例说明：考虑样品的复杂性和分子的形状：

• 简单样品（单一目标分子）：严格遵循上述“1/3 - 1/2”法则即可。

  *例如：50KDa蛋白：

  错误选择：使用50 kDa MWCO的透析袋。会导致目标蛋白大量损失。

  较好选择：选择25 kDa MWCO的透析袋。可以很好地保留蛋白。

  更安全的选择：选择14 kDa或10 kDa MWCO的透析袋。保留效果极佳，但透析平衡时间可能会稍长一点。

• 复杂样品（含有不同大小分子的混合物）：如果您想保留混合物中的大分子而去除小分子，MWCO应设为小于您想保留的最小分子的分子量的1/2。

  *例如：您有一个含有目标酶（100 kDa）和其辅酶（15 kDa）的混合物，现在想去除盐分但保留所有组分。您应该选择MWCO小于 (15 kDa / 2) = 7.5 kDa 的透析袋，比如6-8 kDa的规格。

• 线性分子：对于DNA、RNA或肽段，建议选择比其分子量小得多的MWCO（例如，选择比线性分子分子量小3-5倍的MWCO），以确保有效截留。

4. 透析袋的使用

• 透析袋在使用前一般需要预处理（如用蒸馏水、乙醇或EDTA煮沸），以去除制造过程中残留的甘油、重金属离子和硫化物等杂质，否则可能影响样品活性。有的透析袋仅使用纯化水清洗即可。具体参考品牌提供的详细技术资料或说明书。

• 清洗后的透析袋，经检漏（非常重要）无误后，先使用透析夹夹住一端，加入样品后夹住另一端，再次检漏。推荐使用橡皮筋将透析的样品固定在移液管上（1.可将全部样品浸入透析液中避免浮起；2. 避免沉入底部，磁力搅拌转子将样品打破）。建议使用至少大于样品500倍体积的透析液透析，样品浸入透析液中，间隔时间换液。

  
  注意事项：收集样品前，建议透析液先不要倒掉，若样品误漏且十分珍贵，可尝试浓缩回收样品。

5. 优缺点

• 优点：处理量大：理论上可以处理任意体积的样品，只需使用足够大的透析袋和容器。条件温和：对蛋白质活性影响小，不易导致蛋白质变性或聚集。成本低：透析袋和缓冲液的成本相对较低，适合预算有限的实验室。回收率高：适量补入透析液清洗透析袋回收样品，可大大提高样品回收率。

• 缺点：耗时：整个过程通常需要数小时到甚至过夜，更换外液可能需要多次。样品稀释：由于渗透压作用，透析液会进入透析袋，导致样品体积有一定程度的增加。

6. 适用场景

• 普通的蛋白质置换缓冲液（如：亲和纯化的蛋白-Ni-NTA-含高浓度咪唑、尿素、盐酸胍等，尤其适合使用透析的方式，缓慢的置换缓冲液，有利于蛋白质的复性）

• 蛋白质偶联反应后去除未反应的游离小分子（如：生物素、荧光素等）

• 蛋白质浓缩（如：使用PEG浓缩，覆盖于透析袋表面）

方法二：脱盐柱/凝胶过滤色谱 (Desalting Columns/Gel Filtration Chromatography)

1. 原理：基于分子大小排阻的分离原理。色谱柱中填充了具有特定孔径的惰性凝胶颗粒（如Sephadex G-25）。当样品经过脱盐柱时，大分子蛋白质因无法进入凝胶颗粒的孔径，只能从颗粒之间的空隙流过，路径短，先被洗脱出来；而小分子盐离子可以进入凝胶颗粒的孔径，路径长，后被洗脱出来。从而实现蛋白质和盐的分离。

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2. 选择因素： 上样体积、截留分子量、已有设备。

• 重力柱/离心式脱盐

  （以Cytiva产品为例，填料为Sephadex G-25，排阻限度为 Mr 5000。）常用的脱盐柱如图：

请注意：重力/离心式脱盐柱的的脱盐效率不是100%，往往重力式脱盐效率优于离心式脱盐（离心式脱盐过程中，盐离子会通过离心力从脱盐柱侧壁离下，残留在样品中），常用的脱盐柱总结如下：

注：Thermo产品Zeba™ 系列脱盐离心柱，脱盐效率略高，但相同类型的脱盐柱上样体积小。

优点：操作简单、快速便利；缺点：价格昂贵、不可重复利用、脱盐效率非100%、样品可能会被稀释。

• 脱盐预装柱

  以Cytiva产品为例，可将脱盐柱串联，用于大体积的样品脱盐。但预装柱往往需要搭配蛋白纯化仪使用，而蛋白纯化仪的价格较昂贵。

  

  

优点：操作简单、通过液相可视化蛋白脱盐进程、脱盐效率高、可重复利用；缺点：需要特定设备。

• 散装脱盐填料

  以Cytiva产品为例。需要准备柱管，填料溶胀后加入至柱管中使用。上样体积通常不超过柱床体积的15%-25%以确保良好分离，可搭配简易的恒流泵及核酸蛋白检测仪使用，或者直接依靠重力脱盐使用（速率较慢）。

优点：自由装柱、可重复利用、设备可简可繁；缺点：自制柱子，需要装柱和校准，比较费时。

3. 优缺点总结：

• 优点：快速高效：整个过程通常在几分钟到半小时内完成，远快于透析。分离效果好：通过液相，能清晰查看大分子和小分子分离效率并收集。易于操作：商品化的预装柱，尤其为离心式脱盐柱，使用便利。

• 缺点：上样量有限：样品体积受柱床体积严格限制，不适合处理非常大体积的样品。样品稀释：经过柱分离后的样品会被稀释。成本较高：尤其是离心式脱盐柱，通常为一次性使用，成本比透析高。设备要求高：往往需要蛋白纯化仪，离心机等。

4. 适用场景

• 普通蛋白质快速置换缓冲液

• 精细纯化：需观察蛋白质与脱盐液相色谱图用于收集，搭配蛋白纯化仪使用的精细纯化

• 需要快速脱盐的实验（例如在酶动力学实验前快速去除产物；在蛋白修饰反应中快速去除多余偶联剂用于下游反应）

方法三：超滤 (Ultrafiltration)

1. 原理：超滤利用压力或离心力驱动溶液通过一个超滤膜。该膜具有特定的截留分子量（MWCO），允许小分子和溶剂通过（滤出液），而将大分子蛋白质截留（浓缩液）在样品室中。通过不断加入新的缓冲液（透析液）并继续超滤，可以洗掉样品中的盐分，这个过程称为渗滤或超滤。

*图片来源于网络

2. 选择因素： 样品体积、截留分子量。

3. 使用：选择合适的截留分子量超滤管，按照超滤管的说明书，选择的相应的离心转速即可。超滤浓缩后，同步监测流出液样品浓度，无误后丢弃流出液，避免膜损坏导致的样品丢失。回收样品时，使用移液器适度吹打膜表面，增大回收率。

4. 优缺点

• 优点：操作简单快速：结合了浓缩和脱盐/换液功能，速度较快。同步浓缩：在脱盐的同时，可以保持甚至浓缩蛋白质样品。回收率高：适当吹打超滤管壁，蛋白质回收率较高。处理范围广：有各种规格的超滤管/超滤器，可处理从微升到升级的样品。

• 缺点：潜在剪切力：离心或加压过程中产生的剪切力可能对某些脆弱的蛋白质的活性或结构有影响，甚至蛋白质聚集析出。膜易堵塞：高浓度的蛋白质或杂质容易堵塞膜孔，影响过滤效率。成本高：超滤装置（特别是离心超滤管）成本较高。可能造成浓度极化：膜表面截留的蛋白质形成高浓度层，影响过滤速度和效率。

5. 适用场景

• 需要同时脱盐和浓缩的样品。

• 普通稳定蛋白质的快速置换缓冲液

• 处理各种体积的样品，尤其适合中小体积。

• 简单的蛋白质的纯化