浅谈心肌肌钙蛋白I的自身干扰因素（下）

根据之前的研究报道，正常人群的肌钙蛋白自身抗体阳性率大约在0%-9.9%，而心脏疾病相关人群的自身抗体阳性则高达20%-50%不等。自身抗体的存在可能会导致检测结果假阳性或假阴性的发生。一方面，由于肌钙蛋白自身抗体与肌钙蛋白结合后会形成巨肌钙蛋白复合物，相比于游离的肌钙蛋白（与泌乳素类似），巨肌钙蛋白会在外周循环中存在更长的时间，因此可能会导致结果的“假性”升高；另一方面，肌钙蛋白自身抗体与肌钙蛋白结合后，可能会封闭掉检测试剂中的抗体识别位点，从而导致假阴性结果的出现。由此可见，肌钙蛋白自身抗体是检测结果的不容忽视的干扰因素。

关于肌钙蛋白自身抗体的影响，目前的研究普遍认为肌钙蛋白I分子的中间区域是自身抗体的主要结合区域。然而，肌钙蛋白I分子的中间区域作为分子最稳定的区域，是试剂开发过程中规避蛋白水解的理想表位。因此，肌钙蛋白自身抗体和肌钙蛋白末端蛋白水解便构成了目前cTnI试剂开发的“两座大山”。

通过进一步对cTn自身抗体进行分析，HyTest科学家发现，cTn自身抗体的主要识别区域为cTnI和cTnT的结合区域，而该区域恰好位于cTnI分子的中间区域。然而，通过对AMI患者血液cTn自身抗体的分析却发现，自身抗体对于cTnI检测的干扰会随时间推移逐步减弱。这也从另一方面提示，cTn分子在心肌细胞坏死后释放进入外周循环，其存在形式会随时间发生变化。这与上期文章中提到的“cTn存在形式的复杂多样性”干扰因素相一致，提示使用识别含有“I-C”构象表位的抗体，可能是解决自身抗体干扰的核心策略。

图1. 心梗患者cTnI受自身抗体的影响分析

肌钙蛋白作为肌肉收缩重要的功能与结构蛋白，在心肌和骨骼肌中均有存在。其中，肌钙蛋白I和肌钙蛋白T具有组织器官特异性，均以心肌型（c）和骨骼肌型（sk）存在于心肌组织和骨骼肌组织中，而肌钙蛋白C无组织特异性。虽然cTnI具有组织特异性，然而cTnI与skTnI具有一定的同源型。其中，cTnI与快型skTnI和慢性skTnI分别有46%和52%的相同氨基酸序列。因此，如果cTnI试剂的抗体选择不当，可能会由skTnI的交叉反应导致结果的假阴性。对于hs-cTnI试剂而言，略微的结果升高也可能会导致结果错判。因此，skTnI同源性的干扰是我们在cTnI试剂开发过程中不容忽视的因素。

针对cTnI分子的C末端，HyTest推出了第二代重组单抗，与骨骼肌无交叉反应，可用于开发新一代高敏肌钙蛋白I试剂。欢迎联系我们，申请免费测试样品。

相比skTnI，cTnI在N端有额外的31个氨基酸。通过序列比对发现，cTnI与skTnI同源的区域大部分位于分子的C末端（图2）。然而，如前文所述，C末端是开发cTnI试剂的潜力抗原表位。因此，在选择试剂抗体时，抗体与骨骼肌肌钙蛋白的交叉反应测试是必要的。

图2. cTnI与skTnI的氨基酸序列分析。

紫色区域为同源区域

磷酸化作为常见的蛋白质翻译后修饰，也存在于cTnI分子中。cTnI分子的22和23号丝氨酸是潜在的磷酸化位点，在体内可被蛋白激酶A磷酸化。磷酸化的产生可能会影响抗体的识别，因此在开发cTnI试剂的过程中，选择抗体应考虑磷酸化的影响，以确保检测结果的准确。

肝素是一种带负电的聚糖分子，作为常见的抗凝类药物，已被临床广泛使用。同时，肝素类抗凝采血管也是临床上最常见的采血管之一。cTnI分子的等电点PI为9.9，在正常的生理状态下会带正电。因此，外周循环中cTnI分子可与肝素发生静电吸附，从而对检测结果造成潜在影响。因此，在开发cTnI试剂的过程中，关注抗体对于肝素的敏感性是必要的考虑因素；同时，不同采血管的测试结果可比性也需加以关注。

肌钙蛋白作为检验医学领域“金字塔尖”级别的标志物，检测标准化至今却仍未能实现。早在10年前，国际顶级肌钙蛋白临床检验大咖Fred Apple就曾提出，在他的有生之年将不会看到肌钙蛋白I检测实现标准化。而在10年后的今天，关于肌钙蛋白检测标准化确实仍未取得显著进展。究其原因，仍要归因于上文提到的各类干扰因素以及肌钙蛋白分子复杂的生化性质。

首先，由于肌钙蛋白在外周循环中复杂的存在形式，单一类型的肌钙蛋白抗原很难作为通用的校准品，这也导致目前全球仍无具备互换性的国际标准物质。不同检测试剂之间在测试同一样本的结果差异仍可高达数十倍；同时，单一试剂即使在测试不同形式的肌钙蛋白抗原（单体、二元复合物和三元复合物等），其回收率差异也可高达数倍以上。因此，就目前而言，在开发新一代肌钙蛋白检测试剂时，参考测量程序与校准品抗原的选择至关重要。其次，为了解决肌钙蛋白分子上的多重干扰因素，不同试剂厂家所使用的抗体配对组合也不尽相同。由于不同抗体的反应性及特异性均存在差异，这也导致检测结果差异被进一步放大。同时，叠加校准品来源和溯源路径的差异以及试剂间反应体系及制备工艺的差异，即使不同试剂使用了相同的抗体配对，检测结果的可比性也差强人意。

由此可见，仅基于目前的条件，肌钙蛋白检测标准化的实现几乎是一项不可能完成的任务。由于检测结果缺乏标准化，新开发的试剂想要和不同类型的检测试剂存在结果可比性的可能性基本为0。因此，对于试剂本身而言，如何保证检测结果的准确性以及与临床的符合性才是我们更应关注的重点。

至此，我们分别从cTn存在形式的复杂多样性、cTnI蛋白水解、cTn自身抗体、cTnI与skTnI同源性干扰、cTnI磷酸化以及肝素的干扰和cTnI检测无标准化这6大方面跟大家探讨了高性能cTnI试剂开发的底层逻辑。肌钙蛋白作为检验医学领域“金字塔尖”级别的标志物，在人类健康管理领域发挥着重要的作用。然而开发出高性能的cTn试剂却并非易事，也正因肌钙蛋白的重要性以及开发难度之大，使得人们在不断追求着更“好”更“准”的肌钙蛋白试剂。

参考文献：

1. Alexandra V Vylegzhanina et al. Anti–Cardiac Troponin Autoantibodies Are Specific to the Conformational Epitopes Formed by Cardiac Troponin I and Troponin T in the Ternary Troponin Complex. Clinchem. 2017, 63(1), 343-350.

2. Zhang, J et al. Top-down quantitative proteomics identified phosphorylation of cardiac troponin I as a candidate biomarker for chronic heart failure. J Proteome Res. 2011, 10(9): 4054-4065.

3. Katrukha, AG et al. Biochemical factors influencing measurement of cardiac troponin I in serum. Clin Chem Lab Med. 1999, 37(11-12): 1091-1095.

4. Fred Apple. Counterpoint: Standardization of Cardiac Troponin I Assays Will Not Occur in My Lifetime. Clinchem. 2012, 58(1)， 169-171.